大鼠P选择素(P-Selectin/CD62P)ELISA试剂盒

大鼠P选择素(P-Selectin/CD62P)ELISA试剂盒

检测原理

试剂盒采用双抗原一-步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被病毒性腹泻病毒抗ti的包被微孔中，依次加入标本、HRP标记的检测抗原，经过温育并彻di洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在suan的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在450NM波长下测定吸光度(OD值)，与CUTOFF值相比较，从而判定标本中猪病毒性腹泻病毒(BVDV)的存在与否。

样品收集、处理及保存方法

1.血清:使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆: EDTA、柠檬suan盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液: 3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转 离心10分钟取上清。

5.保存:如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20°C， 避免反

复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品

1.酶标仪(450NM)

2.高精度加样器及枪头: 0.5-10UL、2-20UL、20-200UL、200-1000UL

3.37℃恒温箱

操作注意事项

1.试剂盒保存在2-8°C，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完quan溶解后再使用。

2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封(低温干燥)保存。

3.预处理后的样本请按照操作步骤用样ben稀释ye适当稀释以达到试剂盒的的最jia检测效果。.

4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

5.所有液体组分使用前充分摇匀。

大鼠P选择素(P-Selectin/CD62P)ELISA试剂盒

常用方法：

1.夹心法：

夹心法常用于检测大分子抗原，一般的操作步骤为:

a.将具有专一性的抗ti固著（coating）于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗ti

b.加入待测检体，检体中若含有待测的抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗ti进行专一性键结

c.洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一的一次抗ti，与待测抗原进行键结

d.洗去多余未键结一次抗ti，加入带有酶的二次抗ti，与一次抗ti键结

e.洗去多余未键结二次抗ti，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果

原理：针对抗原分子上2个不同抗原决定簇的单克隆抗ti分别作为固相抗ti和酶标抗ti，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物。

2.间接法

间接法常用于检测抗ti，一般的操作步骤为：

a.将已知的抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余的抗原。

b.加入待测检体，检体中若含有待测的一次抗ti，则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结。

c.洗去多余待测检体，加入带有酶的二次抗ti，与待测的一次抗ti键结。

d.洗去多余未键结二次抗ti，加入酶底物使酶呈色，藉仪器（ELISA reader）测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗ti的含量。

原理：利用酶标记的抗抗ti以检测已与固相结合的受检抗ti。

3.竞争法

竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为：

a.将具有专一性的抗ti固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗ti

b.加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗ti进行专一性键结

c.加入带有酶的抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗ti进行专一性键结，由于塑胶孔盘上固著的抗ti数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酶的抗原可键结的固著抗ti就越少，亦即，两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗ti键结，即所谓竞争法之由来。

d.洗去检体与带有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，当检体中抗原量越多，代表塑胶孔盘内留下之带有酶的抗原越少，显色也就越浅。

e.当需要侦测无法获得两种以上单一性抗ti的抗原，或是不易得到足够的纯化抗ti以固著于孔盘上时，一般会考虑使用竞争法ELISA。

试剂盒小贴士

1.在收到试剂盒后，为保证检测效果，需要根据说明书中保存条件正确储存。除非特别注明，试剂盒大多是在2～8°C条件下储存

2.在实验进行前，请确认包装中的试剂盒成分与说明书一致，再进行后续操作

3.溶解标准品过程中，注意标准品是否受潮，过程中要避免产生泡沫

4.为了避免交叉污染，配置不同浓度标准品、上样、加不同试剂都需要换枪头。另外不同试剂请分别使用不同的移液槽

5.每次孵育时，正确使用封板胶纸可保证结果的准确性

6.正确洗板有助于实验结果的稳定性

7. TMB显色底物在上板前应为无色，请避光保存。加入孔板后，将由无色变成不同程度的蓝色

8.终止液上板顺序需与底物上板顺序一致，加入终止液，溶液颜色由蓝色变为黄色。如果出现绿色，即表明终止液与底物未混匀，请充分混合

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